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正確認(rèn)證酶標(biāo)分析的使用與測(cè)定波長(zhǎng)
作者：admin 時(shí)間：2021-06-08 01:52:20 點(diǎn)擊次數(shù):1920
作為微孔板酶標(biāo)分析儀，其基本功能無非是比色測(cè)量。差異在于測(cè)量波長(zhǎng)范圍、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)速度、振動(dòng)盤功能、溫度控制、定性和定量測(cè)定軟件功能等方面的差異，當(dāng)然，自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)還具有自動(dòng)洗盤、孵育和加樣功能。在臨床實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際工作中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)人員使用酶標(biāo)分析儀進(jìn)行測(cè)量操作時(shí)，有時(shí)難免會(huì)對(duì)酶標(biāo)檢測(cè)儀的一些性能指標(biāo)產(chǎn)生困惑，甚至對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用產(chǎn)生錯(cuò)誤的理解。如使用酶標(biāo)儀比較肉眼觀察陽性率等問題。下面就酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)給大家介紹下。
酶標(biāo)儀的檢測(cè)波長(zhǎng)一般在400~750nm或800nm之間，完全可以滿足ELISA的顏色測(cè)定。目前國(guó)內(nèi)常用的ELISA試劑盒標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(辣根過氧化物酶HRP)，底物多為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)。在氫溶液存在下，HRP將其氧化為2,2，-二氨基偶氮苯(DAB)和二酚醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(zhǎng)處吸收*大。當(dāng)pH值降至L 0時(shí)，*大吸收波長(zhǎng)移至492 nm。同時(shí)，摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，所以常用硫酸等強(qiáng)酸。或者用鹽酸來停止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物二苯醌在450nm波長(zhǎng)處的消光系數(shù)*大。如果HRP的量小，H:O:和TMB的量過多，就會(huì)形成藍(lán)色陽離子。降低pH值可以將藍(lán)色的陽離子自由基轉(zhuǎn)化為黃色的二苯醌。用硫酸作終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90分鐘。因此，450nm和492nm是目前*常用的ELISA檢測(cè)波長(zhǎng)。各種微孔板讀卡器均配有可自動(dòng)切換的過濾器放置部件，可同時(shí)安裝6 - 8個(gè)過濾器。所配置的濾波器應(yīng)包括上述兩個(gè)波長(zhǎng)。490nm濾光片取代了492nm濾光片，效果不大。除了這兩種基本濾光片外，考慮到雙波長(zhǎng)比色法的需要，還應(yīng)該有波長(zhǎng)為620nm或630nm或650nm和405nm的濾光片。其他過濾器可根據(jù)您的需要選擇。有時(shí)，一些實(shí)驗(yàn)室想使用酶標(biāo)板閱讀器進(jìn)行微量生化測(cè)定，因此酶標(biāo)板閱讀器制造商將紫外檢測(cè)功能擴(kuò)展到其酶標(biāo)板閱讀器，此時(shí)需要一個(gè)340 nm波長(zhǎng)的濾光片。此時(shí)酶標(biāo)儀的測(cè)量波長(zhǎng)范圍為340-750nm或800nm。
酶標(biāo)板閱讀器具有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能。有時(shí)用戶不知道在什么情況下使用單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂“單波長(zhǎng)”，就是用*大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行顯色，即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定;而“雙波長(zhǎng)”是用吸收*大的波長(zhǎng)進(jìn)行顯色，即450 nm或492 nm。除了在nm處進(jìn)行比色測(cè)量外，測(cè)量還在對(duì)特定顯色不敏感的波長(zhǎng)進(jìn)行，如630 nm。酶標(biāo)儀印出的吸光度是兩者之間的區(qū)別。在630 nm波長(zhǎng)處獲得的吸光度是非特異性的，來自于平板對(duì)指紋、灰塵、污物等的吸收。因此，在ELISA比色法測(cè)定中，*好采用雙波長(zhǎng)，不需要建立空白孔。
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